Direct cGMP ELISA Kit
(New Non-acetylated Version)
Catalog No.80103
96 Well Kit

灵敏度：14fmol/ml    检测范围：0.016pmol/ml-250pmol/ml

产品描述

工作原理

研究背景

试剂盒组份及保存

      注： 收到试剂盒后 ，若不立即使用 ，请按照标签说明存储在相应的温度。 

试剂盒所需自备物品

样品处理

     纽斯特生物的ELISA试剂盒适用于检测经过盐酸处理而终止内源性磷酸二酯酶活性的cAMP样品。 这种样品可直接应用于检测，而不需要蒸发和进一步的处理。

 试剂盒注意事项

1. 收到试剂盒后若不立即使用 ，请将试剂按照标签说明存储在相应的温度 ， -80℃低温保存的抗体和 酶
储液为避免反复冻融请按每次需要量进行分装冻存；若立即使用，请将整个试剂盒置于4℃保存。
2. 使用前请将试剂盒各个试剂平衡到室温 (至少30min) 。
3. 用试剂预先润洗枪头在使用；取各种样品、标准品和试剂必需更换枪头。
4. 移取标准品和样品到微孔底部。
5. 从微孔的边缘加入试剂 ，以避免污染。
6. 本试剂盒使用可拆分的微孔酶标条 ，使用者可根据样品量多少进行拆分。未使用的酶标条保持干 燥
，密封于试剂盒提供的铝封袋中 ，于4℃保存。微孔酶标条需安装在相应的框架上使用。
7. 在加入显色底物前 ，确保微孔内没有残留的洗涤液。微量残留的洗涤液可能导致分析结果的变化。

 试剂准备

 1. 非乙酰化cGMP标准品

将5000 pmol/mL cGMP标准品溶液平衡至室温。从#2至#7标记七只洁净管。移取475μ L 0.1MHCl 到 #1号试管 ，400μl 到 #2至 #7号试管。加入25μl 5000 pmol/mL cGMP标准品到 #1管中,剧烈涡旋震荡。从 #1管中取出100 μl溶液至 #2 管中 ，涡旋震荡，以此类推, 重复上步操作 ，梯度稀释至#7管。经以上操作 ，#1至 #7 管中cGMP标准品浓度分别为 250, 50 ，10, 2 , 0.4, 0.08 和 0.016pmol/mL (详见cGMP实验稀释操作流程图) 。稀释过的标准品需在30分钟内使用。标记 一只试管作为无标准品空白对照 ( BO) .移 600μl 0.1M HCl 到 B0 管中。

  2.1xAssay Buffer

将15 mL 10×Assay Buffer 加到135 mL去离子水中 ，稀释成工作液。稀释液可在室温保存至试剂盒有效期限 ，或者3个月

3.cGMP-HRP 工作液

实验前计算当次实验所需用量 (以50ul/孔计算) ，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15分钟 ，用配好的1x Assay Buffer,将cGMP-HRP Conjugate ( 1000×) 稀释成1x工作浓度。 当日使用。

4.Anti-cGMP McAb 工作液

实验前计算当次实验所需用量 (以50ul/孔计算) ，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15分钟 ，用配好的1x Assay Buffer,将Anti-cGMP Antibody ( 1000×) 稀释成1x工作浓度。 当日使用。

 实验步骤

  使用前将各种试剂取出放置30分钟 ，平衡至室温。所有标准品和样品必需设置平行对照实验。快速加入试剂至样品中 ,立即漩涡震荡2秒混匀。
1. 依据实验键盘纸决定酶标条的使用量 将剩余的酶标条连同干燥剂一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存
2. 移取50μ L中和液至各个微孔中，除了 TA ( TotalActivity) 孔 和 Blank (空白)孔。
3. 移取100μ L 0.1M HCl 至NSB ( Non-Specific Binding) 孔 和 B0孔 (0pmol/mL cGMP标准品)。
4. 移取100μ L cGMP标准品至相应的孔。
5. 移取100μ L样品至相应的孔。
6. 移取50μ L 1x Assay Buffer 至NSB ( Non-Specific Binding) 孔。
7. 移取50μ L偶联酶至各孔中 ，除了TA (TotalActivity) 孔和 Blank (空白) 孔。
8. 移取50μ L 抗体工作液至各孔中，除了TA (TotalActivity) 孔，Blank(空白)孔。
9. 将酶标孔置于孔板振动器上 ，250~500rpm ，室温孵育2小时。
10. 在吸水纸上拍干微孔内溶液 ，加洗涤液 250 μ L每孔洗3次，每次需拍干。
11. 最后一次洗涤 ，清空各微孔 ，在干净的无尘吸水纸上轻巧酶标板数次 ，以确保没有洗涤液残留。
12. 加5μ L 偶联酶至TA (Total Activity) 孔。
13. 每孔 200μ L显色底物溶液 ，于室温静置5~30分钟。(显色底物A和B需在临用前15分钟内等体积混合 ，并避光放置)
14. 每孔加入50μ L终止液。终止后立即读数。
15. 清除酶标仪Blank(空白)孔值 ，读取450nm处的光密度值 ，在570nm至590nm之间最好有修正。如果酶标仪不能自动清除Blank(空白)孔值 ，那么手动扣除每个读数的Blank(空白)孔光密度值。

下面的曲线不能用于计算cGMP浓度。每次实验需新做一条标准曲线。

灵敏度

通过比较10个B0孔平均光密度值(OD)和10个#6管标准品的平均光密度值，计算出灵敏度。cGMP浓度的检测极限通过标准曲线上0位置的两个标准偏差来测定。

线性关系

cGMP浓度为16.0pmol/mL的样品，用0.1M HCl进行连续七次1:2梯度稀释。将实际的cGMP浓度和测定的cGMP浓度绘制图表。该直线的斜率为1.000，相关系数为0.999。

交叉反应

部分相关化合物的交叉反应由竞争ELISA测定。将可能的交叉反应物溶解到试剂盒分析缓冲液中，浓度从500 pmol/mL至500,000 pmol/mL。将这些样品用该试剂盒测定，实测cGMP浓度以50%B/Bo进行计算。交叉反应的%通过比较检测到的交叉反应物浓度和实际的反应物浓度得到，并以百分比的形式表示。