免疫细胞化学实验操作指南

该免疫细胞化学实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

所需试剂

• PBS 洗涤液. 磷酸盐缓冲液 (PBS). 使用 10x PBS, pH 7.2 (0.2M 磷酸钾, 1.5M NaCl). 用适量去离子水稀释到1x.

• 甲醛固定. 用PBS稀释到 4%.

• 抗体稀释液. 制备100ml 的PBS 洗涤液，加入1ml 与二抗宿主同物种的正常血清.

• 生物素化的二抗. 在抗体稀释液中制备生物素化的二抗溶液. 使用抗一抗宿主的生物素化的二抗.

• 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶. 在PBS缓冲液中制备链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶溶液.

• DAB 底物.

• 苏木精复染色以及固定介质.

步骤

1. 将细胞生长于显微镜载玻片，或盖玻片，或细胞培养板上。除去培养基液，用冰冷的PBS小心清洗细胞3次。用含4%甲醛的PBS溶液于冰上固定细胞30分钟，使用的甲醛溶液应与最初培养基液体积相等。弃去固定液，用PBS冲洗3次每次5分钟。如需要，可在含1% H2O2 的PBS溶液中孵育5分钟，以除去内源的过氧化物酶活性。用PBS清洗固定的细胞3次，每次5分钟。

2. 用抗体稀释液制备适宜浓度的一抗溶液。移去细胞上的缓冲液。加入足够量的一抗使其覆盖细胞。室温下孵育一抗60分钟。如果一抗与抗原的亲和力较低，可于4ºC下过夜孵育。移去一抗溶液。用PBS清洗3次，每次5分钟。

3. 移去细胞上的缓冲液。加入稀释的生物素化的二抗，室温下孵育30分钟。最佳的稀释度每个批次二抗有所不同。用PBS清洗3次，每次5分钟。

4. 移去细胞上的缓冲液。加入稀释的链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，室温下孵育30分钟。移去溶液。 用PBS清洗3次，每次5分钟。

5. 移去缓冲液。加入DAB底物，孵育大概10分钟或者直到反应颜色足够深。

6. 移去溶液。用蒸馏水清洗3次，每次2分钟。用苏木精复染色，根据浓度和所需颜色深度的不同，染色1至5分钟。用蒸馏水清洗3次，每次2分钟。用100%的乙醇给细胞脱水4次，每次2分钟。用二甲苯清洗细胞4次每次2分钟。加入2~3滴固定介质，固定好盖玻片使之风干。

7. 在显微镜下观察细胞。阳性反应应是可见的棕色沉淀。细胞核应显浅蓝色。