免疫荧光实验操作指南

该免疫荧光实验方法仅供参考，由于每个实验使用的试剂不同，并且涉及不同的物种，组织类型及实验应用，实验人员设计应根据具体情况设计实验步骤和改良。

切片制备

A. 细胞涂片

• 将培养的细胞生长于无菌的盖玻片或载破片上，37º C过夜孵育。

• 用PBS简单洗涤。

• 按需固定. 可用的步骤有:

  • 含10% 福尔马林的PBS 固定10分钟 (保持湿润).

  • 冰冷的甲醇固定5分钟，自然干燥。

  • 冰冷的丙酮固定5分钟，自然干燥。

• 用PBS冲洗。

B. 冷冻组织切片

• 在液氮或用液氮预冷的异戊烷中切割冷冻的新鲜组织， 放置于含有OCT冻存液的cryomolds被膜中. 速冻后保存在 – 80 ºC。

• 用恒冷箱切片机将组织切成4-8 um 厚的切片，然后固定在急冻切片或明胶包被过的切片。使用前将切片保存于 – 80 ºC。

• 染色之前，将切片置于室温下 30分钟然后于冰冷的丙酮中固定5分钟。自然干燥30分钟。

• 在PBS中漂洗。

C. 石蜡组织切片

• 将切片在二甲苯中去石蜡两次，每次5min.

• 使用100% 乙醇水化两次，每次3min.

• 使用95%乙醇水化 1min.

• 蒸馏水漂洗.

• 按需根据预制备步骤操作.

组织切片预制备

*对于非石蜡包埋的冷冻切片和培养细胞，请不要使用该预制备步骤。

被福尔马林固定和石蜡包埋封闭的抗原决定簇可以使用抗原修复剂、酶消化或肥皂精等来使之显示。

步骤

1. 在PBS-Tween 20 中漂洗切片两次，每次2分钟。

2. 血清封闭: 用正常血清封闭孵育切片 – 物种来源应与二抗相同, 孵育30分钟来封闭非特异的免疫球蛋白结合。 注意：由于该实验使用的 avidin-biotin 检测系统, 根据组织类型不同，可能需要avidin/biotin 封闭，avidin/biotin 封闭应在正常血清封闭之后。

3. 一抗: 在一抗溶液中孵育切片，室温下1小时或4 °C过夜。

4. 在PBS-Tween 20中漂洗。

5. 二抗： 在生物素化二抗溶液中孵育切片，室温下30分钟。

6. 用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分钟。

7. 检测: 在含FITC-Avidin D 的PBS溶液中孵育切片，室温下30分钟。从该步骤开始要确保切片避光，直到最后将切片用铝箔纸包裹或放进避光盒子中。

8. 用PBS-Tween 20 漂洗三次，每次2分钟。

9. 如需要，用PI 或 DAPI 复染色。

10. 在PBS-Tween 20中漂洗。

11. 用95% 乙醇脱水 2 分钟, 100% 乙醇脱水两次，每次3分钟。

12. 用抗褪色固定介质覆盖切片。