一、目的要求

1、掌握多克隆抗体的制备原理；

2、熟悉多克隆抗体的制备过程

3、了解多克隆抗体效价的鉴定与判断方法

二、原理

抗原分子通常具有多个抗原表位，用抗原免疫动物后，可激发多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答。由活化的B细胞分化成浆细胞分泌抗体进入血液，从血清中分离出多种针对不同抗原表位抗体的混合物即为多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb),也称免疫血清或抗血清。

   高效价抗血清的获取，主要取决于抗原的纯度、免疫原性及免疫程序（如免疫途径、抗原剂量、注射次数与周期等）。为提高抗原的免疫原性，可在免疫动物时加用佐剂。常用的是弗氏佐剂包括弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂两种。

三、材料

1、纯化的人免疫球蛋白IgG。

2、生理盐水或PBS。

3、弗氏完全及不完全佐剂（可自行制作或购买成品）。

4、健康成年兔，雄雌不限，体重1.5～2.5kg。

5、Eppendorf、金属镊子、无菌注射器及6号与9号注射针头。

6、动物固定架，手术器械。

7、酒精棉球及碘氟等。

四、方法

1、按150～200微克/公斤体重称取人免疫球蛋白Ig溶于0.5ml生理盐水进行计算。置于适当容器中进行溶解。

2、逐滴加入等体积的弗氏完全佐剂，用装有9号注射针头的注射器反复抽吸进行乳化，直至取1滴放在冰水面上，不散开即为形成了乳化剂。

3、将体重适宜的健康家兔，用剪刀剪去颈背部及后脚掌的毛发，固定好。用碘

氟、酒精消毒皮肤。

4、用2ml的注射器吸取抗原溶液1ml,于兔颈背部及后脚掌皮下多点注射，每点0.1～0.2ml。

5、间隔2周重复免疫，抗原的剂量及注射部位同上，应用弗氏不完全佐剂进行

乳化。免疫3～4次。

6、末次免疫，可经静脉注射不加佐剂的抗原溶液，剂量为首次免疫的50～60%。

7、免疫血清的效价测定：末次免疫后10天左右，从耳缘静脉取血少许，4℃放置4小时以上，以2000r/min离心10分钟，收获血清。采用免疫双扩散方法测定抗体的效价。

8、经测定，如抗体效价达到要求（一般为1:16以上），采用颈动脉放血法收集血液（应无菌操作），待其凝固后离心收获血清。

五、注意事项

1、抗原乳化剂的制备、动物免疫及收获血清等实验过程中均应注意无菌操作。

2、动物免疫的抗原用量及免疫次数因抗原的性质及不同的动物种类而异。一般免疫3～4次。

3、如经鉴定，抗体效价较低，可再免疫1～2次后收获免疫血清。

六、思考题

1、免疫动物的途径大多采用皮下注射，为什么？

2、制备可溶性抗原的溶液时，加用免疫佐剂的目的是什么？

附：免疫血清的保存方法

    为了减慢抗体效价降低的速度，免疫血清一般采取无菌、低温、高浓度及加防腐剂的方法保存。收获的免疫血清应立即进行分装后-80℃冷冻保存。视具体情况（如免疫血清仅用于体外的实验研究），可加入0.01～0.02%的叠氮钠（NaN₃）作为防腐剂。保存过程中尽可能减少冻溶的次数，以免抗体变性，效价降低。