英文名称 ：cAMP(Cyclic adenosine monophosphate) ELISA KIT

规   格：96T

货   号：80203

 

灵敏度：22.9fmol/ml   检测范围：0.08pmol/ml-250pmol/ml

 

产品说明

环磷腺苷酸(cAMP)和环磷鸟苷酸(cGMP)是在通过对特定蛋白激酶作用来调节细胞内能量代谢的过程中非常重要的第二信使分子。两者都富含于中枢神经系统当中,AMP参与较高的皮质功能,而cGMP参与光转导。cAMP是三磷酸腺苷(ATP)的衍生物 ，在多种不同生物体的细胞内介导cAMP依赖的信号转导通路。cAMP参与细胞代谢、分化、增殖的跨 膜调控机制在恶性生长中具有良好的 细胞抑制和调节体内平衡的作用。

目前商业化提供的一些cAMP检测试剂盒主要应用ELISA的方案 ，使用的是非亲和纯化的cAMP多克隆抗体.尽管具有灵敏性,这些多克隆抗体与ATP存在一定程度的交叉反应。基于ATP是cAMP生产的底物 很有必要找到一种能高特异性识别cAMP的抗体。

纽斯特生物开发出了唯一的鼠单克隆抗体的cAMP ELISA 检测试剂盒。该单克隆抗体对cAMP的特异性比cAMP、ATP等类似的小分子高出108 倍以上。相较于其他的多克隆抗体cAMP试剂盒,纽斯特生物cAMP ELISA试剂盒能显著的提高其灵敏性和特异性 ，且能有效避免来自动物多克隆抗体的批次间差异 ，因此可以提供长久有效地可重复性定量检测。

纽斯特生物cAMP ELISA试剂盒能显著的提高其灵敏性和特异性,且能有效避免来自动物多克隆抗体的批次间差异 ，因此可以提供长久有效地可重复性定量检测。此外 ，其他ELISA试剂盒的多克 隆抗cAMP抗体与乙酰化cAMP的亲和力明显高于非乙酰化cAMP.本试剂盒的单克隆cAMP抗体与乙酰化或非乙酰化cAMP具有同样的亲和力。因此.纽斯特生物cAMP ELISA试剂盒中的样品和标准品不需要乙酰化处理 ，从而明显缩短了分析时间 ，有效避免了乙酰化过程中的有机试剂的使用 ，为大家提供了一个更安全.更健康的工作环境。

 

实验原理

本试剂盒利用竞争酶联免疫分析方法来测定细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cAMP的水平。简而言之，将羊抗鼠多克隆抗体包被在酶标板上,细胞提取物或体外腺苷酸环化酶实验中的cAMP与固定数量的偶联辣根过氧化物酶的cAMP或碱性磷酸酶竞争性的结合抗cAMP单克隆抗体,已知的cAMP作为标准品来做标准曲线。经过一段时间孵育 ，洗掉所有试剂 ，加入底物进行显色。将 多孔板置于酶标仪上 于450nm或405nm波长下 ，进行读数。黄色的光强度与样品中cAMP的浓度 呈反比关系。基于cAMP标准品所得曲线 ，通过测得的光密度可以计算出样品中cAMP的浓度。

研究背景:cAMP作为独特的第二信使 ，可调节细胞对各种外源和内源信号分子的反应。它主要通过激活蛋 白激酶、控制特定的离子通道、磷酸二酯酶调节细胞环核苷酸浓度以及激Epac(通过cAMP直接激活蛋白交换)(3-6)来调节生理过程。通过腺苷酸环化酶可以实现ATP转化为cAMP。哺乳动物体内的主 要腺苷酸环化酶家族均是横跨膜的 ，具有9个亚型 ，且可通过G蛋白Gs或钙离子/钙调素(1)激活。另外,还有一种可溶性的腺苷酸环化酶.可以通过碳酸盐或Ca2 +调节(7)。

 

试剂盒组分及保存

  

组份	货号	储存温度
1.Goat anti-Mouse IgG Coated plate of 96 wells 12x8 well strips in a bag with desiccant	30101	2-8℃
2. cAMP-HRP 1000x stock of HRP conjugated with cAMP, 1x6ul	30202	-80°C
3. cAMP Antibody Anti-cAMP monoclonal antibody (1000X stock), 1x6ul	26002-2	-80°C
4. Neutralizing Reagent tris buffered saline with preservative, 1x6mL	30103	2-8℃
5.10x Assay Buffer phosphate buffer with preservative, 1x15mL	30106	2-8℃
6. cAMP Standard 5000 pmol/mL cAMP, 1x0.1mL	30203	-80°C
7.Substrate A 12ml	30107	2-8℃
8.Substrate B 12ml	30108	2-8℃
9.Sample Diluent                                                                   0.1M HCl, only required for extraction of samples and diluting standard, 1x15mL	30109	2-8℃
10. Stop Solution 2M sulphuric acid, 1x6mL	30110	2-8℃

注：收到试剂盒后 ，若不立即使用 ，请按照标签说明存储在相应的温度。

 

试剂盒所需自备物品

1.去离子水或蒸馏水。

2.浓盐酸。

3.量程在5μ L至1000μ L之间的精密移液管。

4.量程为50μ L和200μ L的中继移液器。

5.用于稀释储液的一次性烧杯。

6.刻度量筒。

7.微孔板振荡器。

8.吸水纸。

9.酶标仪 ，可读波长450nm ，在570nm至590nm之间应有修正。

 

样品处理：

 

纽斯特生物的ELISA试剂盒适用于检测经过盐酸处理而终止内源性磷酸二酯酶活性的cAMP样品。这种样品可直接应用于检测,而不需要蒸发 和进一步的处理。

组织样本：需预先冰冻于液氮中。在不锈钢研钵中用液氮将组子样本研磨成精细粉末。待液氮挥 发完后 ，称量冰冻组织样本并加入10倍体积的0.1M HCl混匀。室温以大于600g离心力离心 ，取上层清夜用0.1M HCl稀释至适当浓度。

细胞样本：首先移除培养基,然后加入0.1MHCl处理细胞。孵育10分钟,并观察细胞是否被裂解；如果裂解充分,接着孵育10分钟并观察。  以大于600g离心力于室温离心,收集上清直接用于实验。临用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%浓度的Triton-x 100可增强细胞和组织裂解。

尿液，血浆和培养液：每ml样品中加入10µL浓盐酸（12M）混匀后，室温离心5min（600 g）留上清，用于本试剂盒检测。血浆、血清、全血和组织匀浆通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它们会干扰实验。用0.1 M HCl处理样品，可以灭活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的浓度，使之可以用于本试剂盒。

 

试剂盒注意事项:

 

 1.收到试剂盒后若不立即使用,请将试剂按照标签说明存储在相应的温度,-80℃低温保存的抗体和酶储液为避免反复冻融请按每次需要量进行分装冻 存,若立即使用，请将整个试剂盒置于4℃保存。

2.使用前请将试剂盒各个试剂平衡到室温(至少30min)  。

3.用试剂预先润洗枪头在使用；取各种样品、标准品和试剂必需更换枪头。

4.移取标准品和样品到微孔底部。

5.从微孔的边缘加入试剂,以避免污染。

6.本试剂盒使用可拆分的微孔酶标条,使用者可根据样品量多少进行拆分。未使用的酶标条保持干燥,密封于试剂盒提供的铝封袋中,于4℃保存。微孔酶标条需安装在相应的框架上使用。

7.在加入显色底物前 ，确保微孔内没有残留的洗涤液。微量残留的洗涤液可能导致分析结果的变化。

 

试剂制备

 

1.非乙酰化cAMP标准品溶液

 

  将5000 pmol/mL cAMP标准品溶液平衡至室温。从#1至#6标记六只洁净试管。移取475μL 0.1M HCl到#1号试管,400μL到#2至#6号试管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP标准品到#1管中,剧烈涡旋震荡。从#1管中取出100μL溶液至#2管中,涡旋震荡。以此类推，重复上步操作.梯度稀释至#6管。经以上操作，#1至#6管中cAMP标准品浓度分别为250, 50，10, 2, 0.4 和0.08 pmol/mL (详见cAMP实验稀释操作流程图).稀释过的标准品需在30分钟内使用。标记一只试管作为无标准品空白对照(NSB)。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。

 

 2.洗涤液

 

  将15mL 10×洗涤液储液加到135 mL去离子水中，稀释成工作液。稀释液可在室温保存至试剂盒有效期限,或者3个月。

 

3. cAMP-HRP Conjugate工作液

 

  实验前计算当次实验所需用量(以50ul/孔计算)，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15分钟，用配好的1xAssay Buffer,将cAMP-HRP Conjugate (1000X),稀释成1x工作浓度。当日使用。

 

4.Anti-cAMP McAb工作液

 

 实验前计算当次实验所需用量(以50ul/孔计算)，实际配置时应多配置100-200ul.使用前15分钟 ，用配好的1xAssay Buffer,将cAMP-HRP Conjugate (1000×) 稀释成1x工作浓度。当日使用。

 

5.操作步骤

使用前将各种试剂取出放置30分钟,平衡至室温。所有标准品和样品必需设置平行对照实验。快速加入试剂至样品中,立即漩涡震荡2秒混匀。

1.依据实验键盘纸决定酶标条的使用量,将剩余的酶标条连同干燥剂一起放回密封塑料袋，密封，4℃保存。

2.移取50μL中和液至各个微孔中 除了TA(Total Activity)孔和Blank(空白)孔。

3.移取100μL 0.1M HCl至NSB (Non-Specific Binding)孔和B0孔(0pmol/mL cAMP标准品)。

4. 移取100μL cAMP标准品至相应的孔。

5. 移取100μL样品至相应的孔。

6. 移取50μ L 0.1M HCl至NSB  ( Non-Specific Binding)  孔。

7.移取50μ L 偶联酶至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔和Blank(空白)孔。

8. 移取50μ L 抗体工作液至各孔中 ，除了TA  (Total Activity)  孔Blank(空白)孔和NSB  ( Non-Spe cific Binding)  孔。

9. 将酶标孔置于孔板振动器上 ，250~500rpm ，室温孵育2时。           

10. 在吸水纸上拍干微孔内溶液 ，加洗涤液300μ L每孔洗三次 ，每次需拍干。

11. 最后一次洗涤 ，清空各微孔 ，在干净的无尘吸水纸上轻巧酶标板数次 ，以确保没有洗涤液残留。

12. 加5μ L 偶联酶至TA  (Total Activity)  孔。

13.每孔200μ L显色底物溶液 ，于室温静置5~30分钟。    (显色底物A和B需在临用前15分钟内等体积 混合 ，并避光放置。  )

14. 每孔加入50μ L终止液。终止后立即读数。

15.清除酶标仪Blank(空白)孔值 ，读取450nm处的光密度值 ，在570nm至590nm之间最好有修正。 如果酶标仪不能自动清除Blank(空白)孔值 ，那么手动扣除每个读数的Blank(空白)孔光密度值。

 

结果判断

1 样品和标准品的净光密度(OD)平均值的计算：净OD平均值 = OD平均值－NSB孔OD平均值
2 计算不同梯度浓度标准品的结合率占最大结合率(B0孔)的百分比 ，计算公式 如下： 百分比值 = (净OD平均值/ B0孔OD平均值)×100
3 以标准品浓度为横坐标，净OD值为纵坐标，通过四参数 Logistic 曲线拟合绘制出标准曲线，通过样品中的插值，即可得到样品中cAMP的浓度

 

标准曲线

下面的曲线不能用于计算cAMP浓度。每次实验需新做一条标准曲线。

 

   

 

灵敏度

通过比较10个B0孔平均光密度值(OD)和10个5号管标准品的平均光密度值 ，计算出灵敏度。cAMP 浓度的检测极限通过标准曲线上0位置的两个标准偏差来测定。

OD(B0平均数) =0.685± 0.003

OD  ( 5号 标准品平均数)  =0.604± 0.010

光密度偏差(0-0.4 pmol/mL) =0.081

2 SD's of the Zero Standard =0.006

灵敏度 =081.0006.0/0.8 ×0.4 pmol/mL =29.6 fmol/mL

 

 

线性关系

 

cAMP浓度为16.0pmol/mL的样品，用0.1M HCl进行连续七次1:2梯度稀释。将实际的cAMP浓度和测定的cAMP浓度绘制图表。该直线的斜率为1.000 ，相关系数为0.999。

  交叉反应部分相关化合物的交叉反应由竞争ELISA测定。将可能的交叉反应物溶解到试剂盒分析缓冲液中 ，浓度从500pmol/mL- 500,000pmol/mL。这些样品通过乙酰化在cAMP竞争分析中被测定 ，通过比  较样品中交叉试剂的实际浓度 ，可以计算出交叉反应 ，并用百分比(%)表示。